Goveji serumski albumin (BSA) in površinska plazmonska resonanca

Goveji serumski albumin (BSA), znan tudi kot "frakcija V" ali peta komponenta, je globulin v govejem serumu, ki je eden najpogosteje uporabljenih proteinov v biokemičnih laboratorijih. Njegov pomen v poskusih je kljub pogosti uporabi morda pogosto spregledan.

Sestava in struktura BSA

BSA je enostaven protein, ki spada med albumine - skupino globularnih (kroglastih) proteinov, ki so topni v vodi in so največkrat nevtralni ali rahlo bazični. Albumin se sintetizira v jetrih kot preproalbumin, ki se nato obdela v proalbumin in izloči v krvni obtok.

  • Aminokislinski ostanki: Prekurzorski protein govejega serumskega albumina vsebuje 607 aminokislin. Po odstranitvi 18 signalnih peptidov in 6 propeptidov z N-terminala nastane zrel BSA protein, ki vsebuje 583 aminokislinskih ostankov. V drugem kontekstu se omenja tudi 607 ali 581 aminokislinskih ostankov.
  • Molekulska masa: BSA ima molekulsko maso približno 66,5 kDa (v virih se pojavljajo tudi vrednosti 66,430 kDa, 66,446 KDa in 68 kD).
  • Izoelektrična točka: Izoelektrična točka BSA je 4,7 ali 4,8.
  • Domene in disulfidne vezi: BSA je zvit v tri homologne domene, ki so med seboj povezane s 17 disulfidnimi vezmi. Te vezi proteinu povečajo stabilnost. Veriga je pretežno (67 %) zvita v obliki α-vijačnice, približno 10 % je ß-strukture. Vsaka domena ima vsaj 2 dolga in en krajši zavoj. 35 cisteinov tvori 17 disulfidnih vezi, zaradi česar se molekula upogne v 9 segmentih in tvori 3 sferoide enakega volumna, s prosto sulfhidrilno skupino na 34. mestu peptidne verige.
  • Aminokisline na površini: Površina BSA vsebuje veliko kislih (40 glutaminske kisline, 59 asparaginske kisline) in bazičnih (59 lizina in arginina) aminokislin, kar mu daje prožnost.
  • Vsebnost: Vsebuje 16 % dušika, 0,08 % sladkorja (le heksoza in heksozamin) ter le 0,2 % maščobe.

Primerjava s človeškim serumskim albuminom (HSA)

Človeški serumski albumin (HSA) predstavlja 55-60 % vseh proteinov v človeški krvni plazmi. Sestavlja ga polipeptidna veriga iz 585 aminokislinskih ostankov v obliki treh homolognih domen, povezanih s 17 disulfidnimi vezmi. Molekulska masa HSA znaša 66 kDa. Spada med najbolj hidrofilne plazemske proteine, z normalno koncentracijo v krvi 3,5-5,0 g/100 ml. BSA ima podobno strukturo in molekulsko maso kot HSA.

Infografika: primerjava strukture BSA in HSA

Vloga in funkcije BSA

Serumski albumini so eni od najbolj raziskanih proteinov zaradi relativno enostavne izolacije. Njihova glavna funkcija je uravnavanje osmotskega tlaka in volumna krvi. Pomembni so tudi kot transportni proteini, saj se lahko vežejo na različne ligande, vključno s prostimi maščobnimi kislinami, nekaterimi ioni (Ca2+, Zn2+ in Cu2+), zdravili in drogami.

Stabilizator in zaščitnik

BSA se pogosto uporablja kot stabilizator v raztopinah za shranjevanje in reakcijo, saj lahko omejuje ali spreminja encime, ki so nestabilni ali imajo nizko aktivnost pri nizkih koncentracijah. Po dodatku BSA lahko protein deluje kot "zaščita" ali "nosilec", kar bistveno izboljša aktivnost mnogih encimov. Na encime, ki ne potrebujejo BSA, dodajanje BSA na splošno ne vpliva.

  • Izboljšanje encimske aktivnosti: Za večino substratne DNK omogoča BSA popolnejšo encimsko cepitev in ponavljajočo se cepitev.
  • Stabilnost encimov: Pri 37 °C, ko encimska reakcija traja več kot 1 uro, lahko BSA naredi encim bolj stabilen, saj mnogi restrikcijski encimi preživijo le 10-20 minut ali manj v reakcijskem pufru brez BSA.
  • Vezava na kovinske ione: BSA se lahko veže na kovinske ione in druge kemikalije v pufru ali substratu DNK, ki zavirajo aktivnost restrikcijskih encimov.
  • Preprečevanje denaturacije: BSA zmanjšuje degeneracijo nekaterih encimov in lahko ublaži neugodne okoljske dejavnike, kot so toplota, površinska napetost in kemični dejavniki. To je morda posledica 17 disulfidnih vezi in tiolov v njegovi strukturi, ki imajo redukcijsko-oksidacijski učinek.
  • Preprečevanje adsorpcije: BSA lahko prepreči adsorpcijo encima na steno cevi in s tem izgubo.
  • Toplotna stabilnost: BSA ima dobro toplotno stabilnost. Pri dvigu temperature na 65 °C je sprememba njegove prostorske strukture še vedno reverzibilna.
  • Povečanje topnosti: BSA se lahko reverzibilno veže s številnimi snovmi, še posebej s tistimi, ki so slabo topne v vodi (maščobne kisline, hem, bilirubin, negativno nabite aromatske spojine), kar poveča njihovo topnost v vodi.

Blokirni reagent v imunskih testih

Med imunskimi testi, kot so ELISA, Western blot (WB) in IHC, je protitelo imobilizirano na trdni površini. Ker so proteini viskozne molekule, se lahko med detekcijo različni proteini v vzorcu nespecifično vežejo na hidrofobna mesta na trdni površini, kar povzroči motnje v ozadju. Zato je potrebno odvečna mesta na površini trdne faze zapreti z blokirnimi reagenti.

  • Lastnosti BSA kot blokirnega reagenta: BSA je globulin z molekulsko maso približno 66,5 kDa. Njegova površina vsebuje veliko število amino in karboksilnih ostankov. Prostorska struktura BSA se lahko spreminja s temperaturo, pH in koncentracijo soli, kar mu daje prožnost.
  • Vezava na aktivirane skupine: Veliko število karboksilnih in amino skupin na površini BSA omogoča vezavo na aktivirane skupine na površini in blokiranje odvečnih mest.
  • Izboljšanje hidrofilnosti: Veliko število karboksilnih skupin na površini BSA lahko izboljša hidrofilnost magnetnih kroglic.
  • Adsorpcija v fosfatni raztopini: Ugotovljeno je, da se BSA bolj kompaktno adsorbira na površini trdne faze v fosfatni raztopini in tvori bolj stabilno strukturo, ker se fosfati združijo z glicinom in argininom na BSA, da odpravijo strukturno elektrostatično odbojnost.
  • Posebnosti pri WB: Čeprav se WB rutinsko blokira s posnetim mlekom v prahu, se BSA priporoča za odkrivanje fosforiliranih proteinov (fosforilirani proteini v posnetem mleku v prahu lahko povzročijo motnje).

Ostale uporabe

Poleg zgoraj omenjenih vlog ima BSA tudi druge pomembne uporabe:

  • Standard za kvantitativno odkrivanje proteinov: Uporablja se kot standard za kvantitativno odkrivanje proteinov v WB in drugih metodah.
  • Dodatek v celični kulturi: V celični kulturi brez seruma dodatek albumina zagotavlja fiziološko in mehansko zaščito ter funkcijo nosilca. Lahko se uporablja kot komponenta za histocelularne (mikrobne in insektne) celice.
  • Analiza sestave mleka: BSA, ki predstavlja 1-2 % vseh proteinov v mleku, vstopa v mleko skozi medcelične stike in ima pomembno vlogo na področju analize in detekcije sestave mleka.
  • Razredčilo in nosilec: Uporablja se kot razredčilo in nosilec v različnih testih, vključno z RIA in ELISA.

Različne stopnje govejega serumskega albumina in njihova uporaba

Različne stopnje BSA so prilagojene za specifične laboratorijske in industrijske aplikacije, odvisno od zahtev glede čistosti in prisotnosti določenih nečistot.

  1. Standardna stopnja BSA (najnižja raven): Uporablja se kot imunski pečat, krma za kulturo in kvantitativni standard za proteine. Čistost je ključna pri industrijski proizvodnji.
  2. BSA diagnostične kakovosti: Izpolnjuje večino rutinskih laboratorijskih zahtev, kot so zaviralci imunskega sistema, stabilizatorji proteinov/encimov, razredčila, nosilci in proteinski standardi. Primerna tudi za imunotest, celično kulturo in hibridizacijske poskuse z visokimi zahtevami glede občutljivosti.
  3. BSA brez IgG, proteaze ali DNaze: Idealen za uporabo kot razredčilo in tesnilo pri testih RIA in ELISA, kjer so nečistote, kot so IgG, proteaze in DNaze, nezaželene.
  4. BSA brez maščobnih kislin (Fatty Acid Free BSA): Vsebnost maščobnih kislin je izjemno nizka (pod 0,02 % ali < 0,002 % (m/m)). Uporablja se kot nosilni protein za elemente v sledovih, maščobne kisline, hormone in rastne faktorje v sistemih kulture brez seruma. Omogoča dodajanje specifičnih maščobnih kislin za spodbujanje rasti celic.
  5. BSA brez proteaze (ProteaseFreeBSA): Ne vsebuje encima DNAse, proteaze in IgG. V glavnem se uporablja za proizvodnjo rekombinantnih proteinov in je primernejši za eksperimentalno tesnilo RIA/ELISA ter razredčilo protiteles.
  6. BSA z nizko vsebnostjo endotoksina (< 2,0 EU/mg): Uporablja se kot naravni nosilni protein v celični kulturi, občutljivi na ravni endotoksinov. Primeren za gojenje celic in tkiv brez seruma ali kemičnih omejitev.
  7. BSA za celične kulture (Cell Grade): 98 % čistost, z zelo nizko vsebnostjo maščobnih kislin in endotoksinov. Namenjen za celično kulturo in povezane poskuse.
Tabela: Pregled različnih vrst BSA in njihova glavna področja uporabe

Metode čiščenja BSA

Proces čiščenja BSA vključuje več korakov za izolacijo in koncentracijo albumina iz plazme.

  1. Obarjanje in raztapljanje beljakovin: Postopek se začne z zajemanjem plazme (npr. 4000 ml).
  2. Prva menjava koncentrirane tekočine (ultrafiltracija): Raztopina proteinov se koncentrira z ultrafiltracijo, pri čemer se uporablja membrana z molekulsko maso 5 KD. Parametri ultrafiltracijske naprave so prilagojeni (npr. pretok 400 ml/min, transmembranski tlak 0,1 psi). Koncentracija je običajno 10-kratna, s hkratno menjavo tekočine z 20 mM natrijevim fosfatnim pufrom, pH 7,0. Pufer se dodaja proteinski raztopini s črpalko s konstantnim pretokom med koncentriranjem.
  3. Kromatografija z ionsko izmenjavo: Pred nalaganjem kolone se za uravnoteženje uporabi natrijev fosfatni pufer 20 mM, pH 7,0 (pretoka 10 ml/min, ravnotežni volumen 5 CV). Proteinske koncentrat se nato kromatografira na koloni (kontrolirana hitrost pretoka 8 ml/min). Po vzorčenju se kolona ponovno uravnoteži s 5 CV uravnotežne raztopine pri pretoku 10 ml/min. Surova raztopina albumina (400 ml) se zbere z gradientno elucijo (od 0 % B do 100 % B za skupno 10 CV) z 20 mM fosfatnim pufrom, ki vsebuje 1 mol/L natrijevega klorida in pH 7,0.
  4. Druga menjava tekočine (ultrafiltracija): Raztopina surovega albumina se ponovno koncentrira z ultrafiltracijo z membrano z molekulsko maso 5 KD. Tekočina se zamenja z natrijevim citratnim pufrom 20 mM in pH 5,0.
  5. Drugo čiščenje (kromatografija s sulfopropil celulozo): Surovi proteinski koncentrat se očisti s kromatografijo s sulfopropil celulozo (sulfopropil ionsko izmenjevalni medij). Pred nalaganjem kolone se za uravnoteženje uporabi natrijev citratni pufer 20 mM, pH 5,0 (pretoka 6 ml/min, ravnotežni volumen 10 CV). Koncentrirana proteinska raztopina se nato kromatografira pri pretoku 4 ml/min, efluent pa se neposredno zbere, da se pridobi 1000 ml raztopine govejega serumskega albumina z visoko čistostjo in nizko vsebnostjo nečistoč.

Izraz "frakcija V" se nanaša na albumin kot peto frakcijo originalne metodologije čiščenja Edwina Cohna, ki je uporabljala diferencialne topne značilnosti plazemskih proteinov. Cohn je z manipulacijo koncentracij topil, pH, ravni soli in temperature uspel izvleči zaporedne "frakcije" krvne plazme. Ta postopek je bil najprej komercializiran s človeškim albuminom za medicinsko uporabo, kasneje pa je bil sprejet za proizvodnjo BSA.

Shranjevanje in stabilnost BSA

Reagent BSA se običajno shranjuje pri temperaturi 2-8 °C. Topnost v PBS je >40 mg/ml, pri pH območju 6,5-7,5. Je topen v vodi. Optična gostota (OD403) za 1-odstotno vodno raztopino je manjša ali enaka 0,15. BSA je stabilen, vendar nezdružljiv z močnimi oksidanti in močnimi kislinami.

Študija vezave polifenolov na BSA z diferenčno dinamično kalorimetrijo (DSC)

Diplomsko delo Mateje Rebernik in mentorice Nataše Poklar Ulrih z Biotehniške fakultete v Ljubljani iz leta 2010 je raziskovalo vezavo polifenolov (kampferol, epigalokatehin, epigalokatehin galat, kampferol-3-glukozid) na goveji serumski albumin z uporabo diferenčne dinamične kalorimetrije (DSC). Študija se je osredotočila na denaturacijo in interakcije z BSA, vključujoč stafilokokni enterotoksin.

tags: #bsa #goveji #serumski #albumin #povrsinska #plazmonska